Reactivos de Transfección

Persuadir al ADN o al ARN a través de la membrana celular hidrofóbica puede resultar un desafío debido a las propiedades hidrofílicas de los ácidos nucleicos. Para superar esto, los científicos confían en una técnica conocida como transfección para introducir ácidos nucleicos exógenos (p. ej., ADN plasmídico, ARNm, ARNsi y oligonucleótidos) en células o líneas celulares primarias eucariotas in vitro o en modelos animales cuidadosamente seleccionados in vivo. Como una poderosa herramienta analítica, la transfección se usa ampliamente en el análisis de la expresión génica para estudiar la sobreexpresión o el silenciamiento de un gen de interés y su efecto posterior en la expresión y funcionalidad de la proteína, para la producción de productos biológicos, como anticuerpos o proteínas recombinantes, o partículas virales recombinantes, y en el desarrollo de terapias basadas en genes.

Transfección estable y transitoria

Según la naturaleza de los nuevos materiales genéticos introducidos y sus efectos a largo plazo en las células, el ADN transfected puede clasificarse como estable o transitorio. En la transfección estable, los ácidos nucleicos exógenos se incorporan al genoma nuclear o persisten como un plásmido episomal, lo que permite que las células transfected y su progenie expresen el gen de interés de forma permanente. La transfección estable generalmente se limita a vectores de ADN, sin embargo, siRNA y miRNA entregados como transcritos de pelo corto también pueden ser transfected de manera estable. Las estrategias de transfección estable son ventajosas para experimentos prolongados, como la producción de proteínas recombinantes, la regulación génica, la terapia génica y el descubrimiento de fármacos.

En la transfección transitoria, el material genético no se integra en el genoma del hospedador. Como resultado, el gen de interés se expresa solo durante un período limitado de tiempo, generalmente de 24 a 96 horas, y no se transfiere a las células hijas durante la división celular. A diferencia de la transfección estable, los materiales genéticos transfectados de forma transitoria pueden perderse debido a factores ambientales o diluirse durante la división celular. Las estrategias de transfección transitoria son más eficientes para transfectar ADN plasmídico superenrollado, pero también se pueden utilizar para transfectar siARN, miARN, ARNm y proteínas. La transfección transitoria es más adecuada para estudios de expresión génica a corto plazo, como la reducción o silenciamiento génico mediante ARN inhibidores y la producción de proteínas a pequeña escala.

Métodos de transfección

Mientras se pueden utilizar varias aproximaciones para transfectar material genético de manera estable o transitoria, generalmente se dividen en tres categorías: métodos físicos, virales y químicos. De los tres tipos principales de transfección, la transfección mediada por productos químicos es la más ampliamente utilizada en la investigación contemporánea debido a su facilidad y rentabilidad.

Transfección mediada físicamente.

Los métodos de transfección física, como la electroporación, la microinyección y la administración de partículas biolísticas, se basan en un conjunto diverso de herramientas físicas que utilizan fuerzas mecánicas o eléctricas para administrar ácidos nucleicos exógenos. La microinyección utiliza un micromanipulador y un microscopio para insertar directamente los ácidos nucleicos en el citoplasma o el núcleo. Aunque requiere mucho tiempo y es técnicamente desafiante, la microinyección brinda a los usuarios la capacidad de controlar la cantidad y el tiempo de entrega de los materiales inyectados y es adecuada para varios tipos de células. El suministro de partículas biolísticas, también llamado bombardeo de partículas, utiliza un dispositivo balístico para disparar ácidos nucleicos recubiertos con partículas de oro en las células a alta velocidad. Es posible que este enfoque no sea tan preciso como la microinyección, pero ofrece un método simple para la transfección transitoria y estable, puede usarse en varios tipos de tejidos y células, incluidas las plantas, y puede administrar conjuntamente múltiples plásmidos con altas frecuencias de cotransformación.

De los diversos tipos de transfección física, la electroporación es la más utilizada. En este método, se aplica un campo eléctrico a las células, que perturba la membrana celular y da como resultado la formación de poros transitorios que facilitan la entrada de material exógeno. La electroporación es aplicable para la transfección transitoria y estable de todos los tipos de células y, en condiciones óptimas, se puede adaptar para la transfección de alto rendimiento. Aunque la transfección física es ventajosa por su baja citotoxicidad y su capacidad para administrar material genético de manera rápida y directa, estos métodos son relativamente severos con las células, lo que provoca la alteración de la membrana celular y, a menudo, da como resultado una muerte celular sustancial.

Transfección mediada por virus

La transfección mediada por virus, también conocida como transducción, se usa ampliamente en la investigación clínica por su alta eficiencia de transfección in vivo y su expresión génica sostenida sin afectar gravemente la viabilidad celular. A diferencia de los métodos de transfección química, no se requiere reactivo de transfección. En cambio, el vector viral infecta las células y entrega el material genético directamente al núcleo. Los sistemas de administración viral comunes incluyen vectores basados en virus adenoviral, oncoretroviral, lentiviral, baculovirus y vaccinia. Aunque la transfección mediada por virus es muy eficaz, las principales preocupaciones asociadas con su uso son la inmunogenicidad, la citotoxicidad y la baja capacidad de empaquetamiento.

Transfección mediada por químicos

La transfección mediada por productos químicos se basa en interacciones electrostáticas para administrar ácidos nucleicos exógenos en las células. En este método, las fuerzas electrostáticas entre las cargas catiónicas de los grupos lipídicos o poliméricos de los reactivos de transfección y los fosfatos de los ácidos nucleicos cargados negativamente hacen que las dos sustancias se asocien, lo que da como resultado complejos de transfección cargados positivamente. Estos complejos de transfección catiónicos, a su vez, interactúan con glicoproteínas cargadas negativamente, como los proteoglicanos de sulfato de heparán, expresados en la superficie celular que desencadenan la captación celular de ácido nucleico exógeno a través de endocitosis o fagocitosis. Los métodos comúnmente utilizados para la transfección química incluyen fosfato de calcio, polímero catiónico y transfección de lípidos catiónicos (consulte la Tabla 1).

Tabla 1. Descripción general de los métodos de transfección química

Método Químico	Principio	Ventajas	Desventajas	Ejemplos
Polímero Catiónico	Los esqueletos de nucleótidos cargados negativamente forman complejos con polímeros catiónicos, que luego son absorbidos por las células a través de la endocitosis.	Económico No se requiere vector viral Se puede aplicar a una variedad de tipos de células.	Muy baja eficiencia de transfección (< 10%) Altamente citotóxico para algunos tipos de células (por ejemplo, células sensibles y generación de líneas celulares estables) Solo se puede utilizar para la transfección transitoria	Diethylaminoethyl (DEAE)-dextran polybrene polyethyleneimine (PEI) dendrimers
Coprecipitado de fosfato de calcio	Los nucleótidos, el calcio y el buffer de fosfato se combinan para formar un precipitado que las células absorben por endocitosis..	Económico Se puede utilizar para la transfección transitoria y estable Las neuronas toleran bien la transfección con poca citotoxicidad	Baja eficiencia de transfección La transfección depende en gran medida de las condiciones experimentales (por ejemplo, constitución celular, pH, calidad y cantidad de nucleótidos utilizados) Citotóxico para las líneas celulares primarias más sensibles	Fosfato de calcio
Lípido Catiónico	Los nucleótidos cargados negativamente forman complejos con lípidos catiónicos, que luego atraviesan la membrana celular y liberan los nucleótidos en el citoplasma a través de la endocitosis.	Fácil de usar, minimo de pasos a seguir Alta eficiencia de transfección Funciona con una amplia variedad de células eucariotas. Efectivo en células y rebanadas disociadas. Sin límite de tamaño de paquete	Difícil de apuntar a células específicas No aplica a todo tipo de células Baja eficiencia de transfección en la mayoría de las células primarias	Transfectamine™ 5000 Transfectamine™ mRNA Lipofectamine

Reactivos de transfección Transfectamine™

Los reactivos de transfección Transfectamine™, desarrollados por AAT Bioquest, son reactivos de transfección de lípidos catiónicos diseñados para administrar ácidos nucleicos exógenos en células eucariotas. El rendimiento de transfección superior y la versatilidad de los reactivos de transfección Transfectamine™ permiten a los usuarios transfectar de manera efectiva varias cargas útiles en una amplia variedad de líneas celulares adherentes y en suspensión, con una eficiencia, viabilidad celular y reproducibilidad excepcionales.

Comparación de la eficiencia de transfección en células HeLa utilizando los reactivos Transfectamine™ 5000, Lipofectamine 2000 y Lipofectamine 3000. Cada reactivo se utilizó para transfectar células HeLa en un formato de 96 pocillos y la expresión de GFP se analizó 24 horas después de la transfección. El reactivo de transfección Transfectamine™ 5000 proporcionó una mayor eficiencia de transfección GFP en comparación con los reactivos Lipofectamine 2000 y Lipofectamine 3000.

Tabla 2. Descripción general de los reactivos de transfección Transfectamine™

Producto	Tipo de célula	Adherente o Suspensivo	Carga útil	Método de entrega	Unidad	Cat No.
Transfectamine™ 5000	(HeLa) células difíciles de transfectar Células Primarias Células madre Células Neuronales Células cancerígenas	Adherent Suspension	DNA Plasmid DNA mRNA RNAi Cotransfection	In vitro delivery	0.5 mL 1 mL 5 mL	60020 60021 60022
Transfectamine™ mRNA	(HeLa) Células Primarias Células madre Células Neuronales Células Cancerígenas	Adherent	mRNA	In vitro delivery	500 µL 5 mL	60030 60031