¿Qué son los Nanodiscos?

¿Qué son los nanodiscos?

¿Qué son los Nanodiscos?

El término nanodiscos describe una pequeña estructura en forma de disco (de 7 a 50 nm de diámetro) que encuentra uso en proteómica y biomedicina. Consta de dos componentes principales:

1. Fosfolípidos, ya sea de origen artificial o de la membrana celular

2. Un cinturón estabilizador que mantiene unidos a los fosfolípidos. Esta es una proteína MSP o un polímero sintético.

Representación esquemática de un nanodisco que estabiliza una proteína de membrana.

Verde: El cinturón estabilizador – Una proteína MSP en este caso

Gris: Fosfolípidos

Naranja: proteína de membrana estabilizada

El Proposito de los Nanodiscos

Su objetivo es imitar la bicapa de fosfolípidos nativos de las células para moléculas diana (a menudo proteínas de membrana). Las proteínas de membrana son la clave para la comunicación entre las células. Intervienen en procesos biológicos fundamentales, como la transducción de señales, los procesos de transporte a través de membranas, la detección de señales químicas y la coordinación de las interacciones célula-célula. Numerosas enfermedades en humanos están vinculadas a proteínas de membrana, lo que las convierte en objetivos importantes para el desarrollo de fármacos. Por lo tanto, parece sorprendente que las proteínas de membrana estén codificadas por hasta ~23 % de los genes, pero representen <1 % de las estructuras proteicas conocidas (1).

Figura 1: Las proteínas de membrana tienen partes hidrofóbicas e hidrofílicas.

Los nanodiscos los hacen solubles en soluciones acuosas.

El problema es que las proteínas de membrana, a diferencia de las proteínas solubles, son difíciles de analizar en su entorno nativo, debido a su inserción en la membrana lipídica. Las superficies de las proteínas de membrana en el núcleo hidrofóbico de la bicapa lipídica también son hidrofóbicas, mientras que las áreas superficiales en contacto con el ambiente acuoso de la membrana son tan hidrofílicas como las superficies de las proteínas solubles ordinarias (2). La presencia de extensas superficies hidrofóbicas e hidrofílicas en la misma molécula es característica de las proteínas de membrana. Como resultado, las proteínas de membrana no son solubles en buffers acuosos estándar sin un agente solubilizante. Por ejemplo, se requieren nanodiscos para solubilizarlos para imitar el entorno anfipático de una bicapa lipídica mientras se mantiene la estructura de la proteína de membrana en un estado fisiológicamente relevante.

Dos tipos de Nanodiscos

Figure 2: Two types of nanodiscs exist: Synthetic nanodiscs (blue stabilizer) and MSP nanodiscs (green stabilizer).

Como se mencionó antes, los nanodiscos se pueden diferenciar entre su composición de fosfolípidos y, lo que es más importante, su tipo de estabilizador. Este estabilizador es la razón por la cual los nanodiscos en total se dividen en dos categorías principales: Nanodiscos MSP y Nanodiscos sintéticos.

Los respectivos nombres se originan en el tipo de estabilizador que se utiliza para mantener los nanodiscos juntos y formarlos en primer lugar. También decide de qué se compone la composición lipídica del nanodisco. Los nanodiscos de MSP siempre contienen una composición lipídica artificial. Lo que significa que usted tiene el control total de la misma. Por el contrario: los nanodiscos sintéticos utilizan los fosfolípidos de las células nativas para crear el nanodisco. Puede encontrar una comparación directa de las ventajas individuales de ambos nanodiscos aquí.

Tabla 1: Pequeña comparación entre MSP y nanodiscos sintéticos

	SYNTHETIC NANODISC	MEMBRANE SCAFFOLD PROTEIN (MSP) NANODISC
Belt properties / Stabilizer	synthetic polymers (e.g. DIBMA, SMA)	MSP proteins
Lipids	Native cell membrane lipids	Artificial phospholipid environments (e.g. phospholipids)
Examples	Diisobutylene-maleic acid (DIBMA), styrene-maleic acid (SMA), amphipols	Pre-Assembled nanodiscs

Pero primero, presentemos ambos tipos de nanodiscos por separado, comenzando con los nanodiscos MSP.

Nanodiscos MSP

Los nanodiscos de MSP se mantienen unidos por proteínas de andamiaje de membrana (MSP). Las MSP pueden ser formas truncadas de apolipoproteína (apo) A-I que envuelven un parche de bicapa lipídica para formar una partícula similar a un disco o nanodisco (5). Las MSP proporcionan una superficie hidrofóbica frente a la cola hidrofóbica de los lípidos y una superficie hidrofílica en el exterior. Esta configuración hace que los nanodiscos sean altamente solubles en soluciones acuosas. Una vez ensambladas en nanodiscos, las proteínas de membrana pueden mantenerse en solución en ausencia de detergentes (5).

Tamaño: El tamaño de un nanodisco MSP puede oscilar entre 7 y 17 nm. Está determinado por la proteína de andamiaje de membrana utilizada. La Tabla 2 muestra las proteínas de andamiaje de membrana que ofrece Cube Biotech y los tamaños de nanodisco a los que conduce. Los nanodiscos de MSP de la misma proteína MSP son de tamaño uniforme y solo difieren en +/- 1 nm en diámetro. Esto les conviene perfectamente para los estudios Cryo-EM.

Otras ventajas de los nanodiscos MSP
Los nanodiscos de MSP tienen una serie de ventajas en comparación con otros sistemas para la solubilización y reconstitución de proteínas de membrana, en particular para estudios de unión de ligandos, análisis de dinámicas conformacionales y estudios de interacción de proteínas (6). Los nanodiscos se pueden utilizar para reconstituir proteínas de membrana como GPCR o transportadores en un entorno artificial que se asemeja a la membrana nativa.

Tabla 2: Descripción general de las proteínas MSP y los tamaños de nanodisco resultantes

Tipo MSP	Tamaño (Diam. en NM)	REF
MSP1D1ΔH5	8.2 (+/- 0.6)	(5)
MSP1D1	9.5 (+/- 1.1)	(5)
MSP1E3D1	13 (+/-1)	(15)
MSP2N2	17 (+/-1)	(21)

Estas proteínas estabilizadas con nanodiscos se pueden purificar directamente mediante procedimientos cromatográficos estándar. El complejo nanodisco de proteína de membrana purificada resultante se puede usar en aplicaciones que requieren acceso a las superficies fisiológicamente intracelulares y extracelulares de la proteína y, por lo tanto, permite el acceso sin restricciones a antagonistas, agonistas, proteínas G y otros socios de interacción (7).

Cómo generar MSP nanodisco + proteína – complejos

Figura 4: Imagen esquemática de dos formas de reconstituir proteínas en nanodiscos. A: Los nanodiscos ensamblados se agregan a una reacción sin células. La proteína naciente puede insertarse espontáneamente. B: Se añaden detergente y MSP a las células que expresan la proteína de interés. Se forma un complejo de fosfolípidos de membrana, proteínas y MSP.

A: Combinación de nanodiscos y sistemas de expresión sin células A partir de un plásmido de expresión, se pueden producir proteínas de membrana en sistemas libres de células. En la mezcla se suministran nanodiscos preensamblados que integran la proteína de membrana naciente (8). No se requiere la adición de detergentes, lo que minimiza posibles artefactos. Opcionalmente, se pueden incluir modificaciones como la biotinilación o el marcaje de isótopos.

B: Reconstitución en dos pasos de proteínas solubilizadas con detergente Partiendo de una proteína de membrana purificada en un detergente adecuado, se añaden proteínas de estructura de membrana y fosfolípidos. Los nanodiscos que contienen la proteína de membrana se forman espontáneamente y se pueden purificar mediante cromatografía de afinidad o exclusión por tamaño (6, 7).

C: solubilización directa de las membranas Partiendo de membranas que expresan la proteína de interés, se añaden detergente y proteína de estructura de membrana. Los fosfolípidos de membrana, la proteína de membrana y la MSP se ensamblan para formar el complejo de nanodisco (5). Aquí, se obtiene una mezcla de complejos de nanodiscos que representan la población de proteínas de membrana, que pueden usarse para estudios de proteómica. Si es necesario, los complejos individuales de nanodisco de proteína de membrana se pueden purificar mediante cromatografía de afinidad. En comparación con el método B, el tiempo de exposición a los detergentes es significativamente más corto (horas frente a días).

Elección de fosfolípidos: la clave para una actividad proteica adecuada

Como ya se mencionó, la composición de fosfolípidos de un nanodisco de MSP es artificial. Lo que significa que los fosfolípidos utilizados que deben constituir el entorno de membrana artificial para la proteína de membrana de interés deben decidirse antes. Pero hay numerosos fosfolípidos para elegir, entonces, ¿cuál elegir? Consulte esta lista de nuestros fosfolípidos más utilizados para nanodiscos MSP, cuando se enfrente a esta pregunta.

Dimyristoyl-glycero-phosphocholine (DMPC)

Palmitoyl-oleoyl-phosphatidylcholine (POPC)

Phosphatidylglycerol (DMPG)

Esta selección, pero también muchos otros fosfolípidos, se han utilizado con éxito solos o en combinación (8,25). Se ha demostrado que la elección de los lípidos es crucial para la actividad de la proteína (8), por ejemplo, en los casos en que los lípidos promueven la oligomerización de proteínas (25). La expresión libre de células usando nanodiscos ensamblados es una forma rápida y fácil de examinar una variedad de lípidos y mezclas de lípidos para determinar su efecto sobre la proteína. Cuando las proteínas se solubilizan directamente de la fracción de membrana, los fosfolípidos endógenos se transportan y se incorporan al complejo de nanodiscos, lo que puede mejorar la actividad de la proteína.

Ejemplos de aplicaciones de nanodiscos MSP en la ciencia

Los nanodiscos MSP fueron descritos por primera vez por Sligar y colaboradores (3,4). Proporcionan el entorno perfecto para estabilizar proteínas de membrana para estudiar la unión de ligandos, agonistas o antagonistas mediante métodos como NMR y SPR (9,10). Se demostró que los nanodiscos aumentan la resolución de las regiones proteicas que atraviesan la membrana en Cryo-EM (22,26). Las proteínas de andamiaje de membrana se pueden etiquetar con histidinas para facilitar la purificación, detección e inmovilización del complejo proteína-nanodisco. Otras aplicaciones de nanodiscos incluyen resonancia Raman (11), MALDI (13), espectrometría de masas no covalente (25), estudios de activación de proteínas (14), espectroscopia de fluorescencia resuelta en el tiempo (15) y cristalización de proteínas (24). Se han utilizado antígenos reconstituidos en nanodiscos para aumentar las respuestas inmunogénicas en ratones, mostrando su potencial para ser utilizados como vacunas (16). Además, todo el proteoma de membrana de E.coli se reconstituyó en nanodiscos, creando así una biblioteca de proteínas de membrana solubilizadas (15). Las proteínas reconstituidas en nanodiscos se pueden transferir a bicelas para mejorar la resolución de RMN (23). Incluso las proteínas solubles que interactúan con los lípidos se analizaron con la ayuda de nanodiscos (20). La Tabla 3 enumera ejemplos de aplicaciones de nanodiscos.

Nanodiscos Sintéticos

Los nanodiscos sintéticos son la segunda gran opción en el campo de los nanodiscos. Se diferencian en ciertos aspectos clave de sus contrapartes MSP, pero también comparten ciertas similitudes.

Creación de nanodiscos sintéticos

A diferencia de las tres formas de creación de nanodiscos MSP (figura 4), los nanodiscos sintéticos solo se pueden crear directamente a partir de células intactas. El polímero sintético utilizado tiene una doble función durante este proceso. Primero, disuelve la membrana celular, similar a un detergente. Luego forma una estructura de nanodisco alrededor de las proteínas de la membrana utilizando los fosfolípidos de las células nativas. Una buena analogía de este proceso es un cortador de galletas que sella las galletas de la masa.

Figura 5: Representación esquemática de un nanodisco sintético que estabiliza una proteína de membrana hipotética. La leyenda de la figura menciona SMA como el polímero estabilizador utilizado, pero p. DIBMA también podría desempeñar este papel.

Tamaño

Los nanodiscos sintéticos son variables en su tamaño. El principal factor que decide su diámetro es el tamaño del complejo proteico de membrana que rodean y estabilizan. Por lo tanto, no se puede dar un tamaño definitivo para un nanodisco sintético. Pero todos varían en el rango de tamaño que también se puede encontrar en los nanodiscos MSP (tabla 2). Esto se aplica a todos los polímeros establecidos hasta ahora. Si se desea un tamaño de nanodisco uniforme para un complejo de nanodiscos sintéticos, se debe realizar una cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) después de que la proteína de membrana estabilizada de interés haya sido purificada por ejemp. cromatografía de afinidad con la etiqueta Rho1D4.

¿Qué polímero?

La selección de diferentes polímeros para nanodiscos sintéticos crece constantemente. Cada uno con sus propias ventajas y desventajas. DIBMA, por ejemplo, tiene una absorción similar a la de una proteína a una longitud de onda de 280 nm. Mientras tanto, AASTY tiene diámetros de nanodiscos bastante fijos en comparación con otros polímeros.

Sin embargo, esto es solo un pequeño extracto de una larga lista de pros y contras de los diferentes polímeros. Dedicamos a este tema su propia página web. ¡Échale un vistazo!

Figure 6: DIBMA and SMA seem to be interchangeable in the first view, but there are some differences.

Puede encontrar información más detallada sobre los diferentes polímeros para nanodiscos sintéticos aquí:

Nanodiscos MSP o Sintéticos?

Entonces, después de todo esto, la pregunta sigue siendo ¿qué tipo de nanodisco se adapta mejor a su proyecto? Tanto MSP como los nanodiscos sintéticos están destinados a la solubilización y estabilización de proteínas de membrana al imitar un entorno de membrana celular. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, hay algunas diferencias clave entre los dos. La Tabla 4 enumera todas las diferencias y sus respectivas ventajas y desventajas.

Tabla 4: Comparación directa entre MSP y nanodiscos sintéticos.

Nanodiscos MSP	Nanodiscos Sintéticos
Tamaño Dependiendo de la proteína MSP utilizada. Uniforme (+/-1 nm) para cada proteína MSP) Ventaja: Los tamaños uniformes hacen que los nanodiscos MSP sean herramientas perfectas para aplicaciones como Cryo-EM.	Tamaño Variable, debido a las diferentes longitudes de las cadenas poliméricas. Ventaja: La variabilidad del diámetro omite los pasos de detección que son necesarios cuando se trabaja con nanodiscos MSP..
Composición lipídica Artificial. Proporcionado por el científico. Ventaja: El científico tiene control total sobre la composición de fosfolípidos.	Composición lipídica Formado por lípidos de la membrana celular nativa. Ventaja: La proteína de membrana se estabiliza en una parte de su entorno nativo.
Absorción ultravioleta Se superpone con la proteína de membrana debido a la presencia de las proteínas MSP. Nota: Debido a las proteínas MSP, el propio nanodisco tiene una señal UV a una longitud de onda de 280 nm e interfiere con los intentos de cuantificación de proteínas a través de la absorbancia.	Absorción ultravioleta SMA se comporta como los nanodiscos MSP, pero los nanodiscos basados en DIBMA no absorben longitudes de onda de 280 nm. Ventaja: Con los nanodiscos basados en DIBMA, la cantidad de proteína se puede determinar fácilmente midiendo la absorbancia de la solución a una longitud de onda de 280 nm.
Creación Se puede crear de 3 formas diferentes (ver figura 4). Ventaja: Las diferentes situaciones en las que los nanodiscos de MSP pueden estabilizar las proteínas de membrana los convierten en la opción preferida a menudo.	Creación Solo directamente desde la célula. Nota: Dado que los polímeros sintéticos utilizan material de membrana celular nativo para crear los nanodiscos, solo se pueden estabilizar las proteínas de membrana del material celular vivo.
Participación de los detergentes Involucrado al principio antes de que la proteína MSP forme el nanodisco alrededor de la proteína de interés. Nota: Debe elegirse un detergente que no afecte a la estructura de la proteína plegada. Esto puede resultar en algo de trabajo extra.	Participación de los detergentes No necesita detergente. Ventaja: Los polímeros actúan como solubilizantes y estabilizadores simultáneamente. Por lo tanto, no se necesitan detergentes adicionales.

Referencias de Literatura

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Los nanodiscos MSP están protegidos por las patentes estadounidenses 7,691,414; 7.662.410; 7.622.437; 7.592.008; 7.575.763; 7.083.958; 7,048,949