Los tintes Fluo-8® están desarrollados para mejorar la carga celular y la respuesta de calcio mientras mantienen las cómodas longitudes de onda espectrales Fluo-3 y Fluo-4 de Ex/Em = ∼490/∼520 nm.
Descripción
Las mediciones de calcio son fundamentales para numerosas investigaciones biológicas. Las sondas fluorescentes que muestran respuestas espectrales al unirse a Ca2+ han permitido a los investigadores investigar los cambios en las concentraciones de Ca2+ libres intracelulares mediante microscopía de fluorescencia, citometría de flujo, espectroscopia de fluorescencia y lectores de microplacas de fluorescencia. Fluo-3 AM y Fluo-4 AM se utilizan más comúnmente entre los indicadores de calcio excitables por luz visible para la obtención de imágenes de calcio de células vivas. Sin embargo, Fluo-3 AM y Fluo-4 AM son solo moderadamente fluorescentes en células vivas tras la hidrólisis de esterasa y requieren de condiciones difíciles para cargar celulas s para maximizar sus respuestas de calcio celular.
Los tintes Fluo-8® están desarrollados para mejorar la carga celular y la respuesta de calcio mientras mantienen las cómodas longitudes de onda espectrales Fluo-3 y Fluo-4 de Ex/Em = ∼490/∼520 nm. Fluo-8® AM se puede cargar en células a temperatura ambiente, mientras que Fluo-3 AM y Fluo-4 AM requieren 37 °C para la carga de células. Además, Fluo-8® AM es dos veces más brillante que Fluo-4 AM y cuatro veces más brillante que Fluo-3 AM. AAT Bioquest ofrece un conjunto de nuestros destacados reactivos Fluo-8® con diferentes afinidades de unión al calcio (Fluo-8® Kd = 389 nM; Fluo-8H™ Kd = 232 nM; Fluo-8L™ Kd = 1,86 µM; Fluo-8FF ™ Kd = 10 µM).
También ofrecemos tamaños de envases versátiles para satisfacer sus necesidades especiales (p. ej., envases de 1 mg, 10 x 50 µg, 20 x 50 µg y HTS) sin cargo de embalaje adicional.
| Catalogo | Producto | Presentación |
|---|---|---|
| AAT-21080 | Fluo-8®, AM | 1 mg |
| AAT-21081 | Fluo-8®, AM | 5×50 ug |
| AAT-21082 | Fluo-8®, AM | 10 x 50 ug |
| AAT-21083 | Fluo-8®, AM | 20 x 50 ug |
Importante: Solo para uso en investigación (RUO). Almacenamiento: Congelar (< -15 °C); Minimizar la exposición a la luz
Plataforma
Microscopio de Fluorescencia
| Excitación | FITC |
| Emisión | FITC |
| Placa recomendada | Pared negra, fondo claro |
Lector de microplacas de fluorescencia
| Excitación | 490 nm |
| Emisión | 525 nm |
| Corte | 515 nm |
| Placa Recomendada | Pared negra, fondo claro |
| Especificaciones instrumento | Modo de lectura inferior/Manejo de líquidos programable |
PREPARACION DE SOLUCIONES DE STOCK
A menos que se indique lo contrario, todas las soluciones madre no utilizadas deben dividirse en alícuotas de un solo uso y almacenarse a -20 °C después de la preparación. Evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación
Prepare una solución madre de 2 a 5 mM de Fluo-8® AM en DMSO anhidro de alta calidad.
PREPARACION DE SOLUCIONES DE TRABAJO
El día del experimento, disuelva Fluo-8® AM en DMSO o descongele una alícuota de la solución madre del indicador a temperatura ambiente. Prepare una solución de trabajo de tinte de 2 a 20 µM en un buffer de su elección (p. ej., buffer Hanks y Hepes) con Pluronic® F-127 al 0,04 %. Para la mayoría de las líneas celulares, se recomienda Fluo-8® AM a una concentración final de 4-5 μM. La concentración exacta de indicadores necesarios para la carga de células debe determinarse empíricamente.
Nota El detergente no iónico Pluronic® F-127 se usa a veces para aumentar la solubilidad acuosa de Fluo-8® AM. Se puede comprar una variedad de soluciones Pluronic® F-127 de AAT Bioquest.
Nota Si sus células contienen transportadores de aniones orgánicos, se puede agregar probenecid (1-2 mM) a la solución de trabajo del colorante (la concentración final en el pocillo será de 0,5-1 mM) para reducir la fuga de los indicadores desesterificados. Se puede comprar una variedad de productos de probenecid ReadiUse™, que incluyen sal de sodio soluble en agua y solución estabilizada, en AAT Bioquest.
Calculadora
Preparación de la solución de stock común
Volumen de DMSO necesario para reconstituir la masa específica de Fluo-8®, AM a la concentración dada. Tenga en cuenta que el volumen es solo para preparar la solución madre. Consulte el protocolo experimental de muestra para conocer los buffers experimentales/fisiológicos apropiados.
| 0.1 mg | 0.5 mg | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 95.517 µL | 477.587 µL | 955.174 µL | 4.776 mL | 9.552 mL |
| 5 mM | 19.103 µL | 95.517 µL | 191.035 µL | 955.174 µL | 1.91 mL |
| 10 mM | 9.552 µL | 47.759 µL | 95.517 µL | 477.587 µL | 955.174 µL |
Imagenes
Figura 1. Se sembraron células U2OS durante la noche a 40 000 células/100 µl/pocillo en una placa costar de fondo transparente/pared negra de 96 pozos. Se retiró el medio de cultivo y se incubaron las células con, 100 µL de Fluo-3 AM, Fluo-4 AM y Fluo-8® AM , respectivamente, en HHBS a una concentración de 4 uM a una temperatura de 37 °C, CO2 al 5 % incubando durante 1 hora. Las células se lavaron dos veces con 200 µL de HHBS, luego se tomaron imágenes con un microscopio de fluorescencia (Olympus IX71) usando el canal FITC.
Figura 2. Diferencia en la intensidad de fluorescencia de a flexión de los músculos de las patas de insectos del escarabajo de control y el escarabajo después de la dosificación oral con indicadores químicos. (A) Fluo-8; (B) rodamina 123; (C) DiBAC4(3); (D) rodamina B; y (E) rastreador celular. La pata de escarabajo dosificada con Fluo-8, Rhodamine 123 y DiBAC4(3) se observó bajo una luz de excitación de 460–480 nm y la fluorescencia emitida se recogió dentro de 495–540 nm. La pata de escarabajo dosificada con Rhodamine B y Cell Tracker se observó bajo una luz de excitación de 535–555 nm y la fluorescencia emitida se recogió dentro de 570–625 nm. La intensidad de la fluorescencia se midió en las 2 regiones de interés (ROI) que se muestran en la figura S1A. Las imágenes obtenidas se digitalizaron con el software ImageJ y la intensidad promediada se muestra en cada gráfico de barras. Los gráficos de la columna de la derecha muestran las intensidades de fluorescencia de cada pata de escarabajo dosificada con diferentes indicadores químicos (centro) en comparación con la pata de escarabajo de control (izquierda). Los escarabajos controles se alimentaron con gelatina casera (sin indicador químico añadido) durante 2 días antes de la observación. Las barras de error representan la desviación estándar (S.D.) (N = 5 escarabajos, n = 30 patas de escarabajo para control, DiBAC4(3), rodamina B y rodamina 123; N = 9 escarabajos, n = 30 patas de escarabajo para Fluo-8 y rastreador celular). Cada conjunto de datos se comparó con el conjunto de datos de la pierna de control mediante la prueba t de Student (Fluo-8, p = 1,42 × 10-4; Rhodamine 123, p = 4,65 × 10-5; DiBAC4 (3), p = 6,26 × 10- 9; Rodamina B, p = 1,15×10-9 y Cell Tracker, p = 7,10×10-3). La escala de colores se encuentra en la esquina inferior izquierda de la imagen. El aumento en la intensidad de la fluorescencia para el escarabajo dosificado con indicador químico en comparación con el escarabajo control indica que el exitoso método de dosificación oral administrado y la entrega de varios indicadores químicos para etiquetar el músculo de la pata del escarabajo. bibliografía: Gráfico de dosificación oral de indicadores químicos para el control in vivo de la dinámica de Ca2+ en el músculo de insectos por Ferdinandus et al., PLOS, enero de 2015.
Figura 3. Efecto de varias frecuencias de estimulación eléctrica sobre la dinámica del Ca2+ y el desplazamiento muscular en el músculo de la pata del escarabajo. Imágenes del músculo de la pata del escarabajo que se dosificó con (A) Fluo-8 (60 µM) y (C) Cell Tracker (60 µM), con la selección amarilla que indica el ROI que se usó para el análisis (como también se muestra en S1B Fig. ). La escala de colores se encuentra en la esquina inferior izquierda de la imagen. Cursos de tiempo representativos que muestran la dinámica de intensidad de fluorescencia de (B) Fluo-8 y (D) Cell Tracker bajo varias estimulaciones eléctricas de múltiples trenes de pulso (50 Hz, 10 Hz, 1 Hz, 100 Hz, 1 Hz y 50 Hz; Ciclo de trabajo del 10%; 2 V) observados desde el ROI que se muestran en (A) y (C) respectivamente. Todas las estimulaciones eléctricas se aplicaron durante períodos de 3 segundos con un período de descanso de 27 segundos entre estimulaciones. El momento del estímulo se indica con sombreado gris. (E) Cambio relativo en la intensidad de la fluorescencia ((ΔF/F0)×100 %) para Fluo-8 (azul) y Cell Tracker (rojo) bajo diferentes frecuencias de estimulación eléctrica (50 Hz, 10 Hz, 1 Hz, 100 Hz, 1 Hz y 50 Hz; ciclo de trabajo del 10 %; 2 V). Los pequeños números al lado de cada parcela indican el orden de estimulación; es decir, primero desde 50 Hz seguido de pulsos de frecuencia variable (10 Hz, 1 Hz, 100 Hz, 1 Hz y 50 Hz). El gráfico de intensidad de Fluo-8 muestra que la dinámica de Ca2+ depende de la frecuencia de estimulación eléctrica, mientras que el gráfico de Cell Tracker muestra que el desplazamiento muscular contribuye en pequeña medida. Fuente: Gráfico de dosificación oral de indicadores químicos para el control in vivo de la dinámica de Ca2+ en el músculo de insectos por Ferdinandus et al., PLOS, enero de 2015.
Figura 4. Falla de la eliminación de PI3K-C2α para inhibir la respuesta de calcio inducida por antígeno. Las células sensibilizadas con IgE se incubaron con colorante Fluo-8 a 25 °C durante 20 min. Las células se lavaron y estimularon con DNP-BSA 1 µM a 30°C. Se monitorearon las intensidades de fluorescencia promedio (F) de las células individuales. Los datos se muestran como ΔF/F0, donde F0 es el valor basal de F obtenido como la intensidad promedio de las células individuales y ΔF es la diferencia entre F y F0. Los datos se obtuvieron de tres experimentos separados (se controlaron 24 células en total) y se muestran como la media ± s.d. Fuente: Gráfico de la participación de la fosfoinositida 3-quinasa α-isoforma de clase II en la desgranulación inducida por antígeno en células RBL-2H3 por Kiyomi Nigorikawa et al., PLOS, octubre de 2014.
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Bibliografía
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Geraniol-Mediated Suppression of Endoplasmic Reticulum Stress Protects against Cerebral Ischemia–Reperfusion Injury via the PERK-ATF4-CHOP Pathway
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Hypothermia evoked by stimulation of medial preoptic nucleus protects the brain in a mouse model of ischaemia
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Leaf-venation-directed cellular alignment for macroscale cardiac constructs with tissue-like functionalities
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Referencias
Ver todas las 26 referencias: Citation Explorer
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A Meta-Analysis of Common Calcium Indicators
Dendritic Calcium Activity Precedes Inspiratory Bursts in pre-Bötzinger Complex Neurons
Fluo-8® Calcium Reagents and Screen Quest™ Fluo-8 NW Calcium Assay Kits
Green Tea Polyphenol Epigallocatechin Gallate Activates TRPA1 in an Intestinal Enteroendocrine Cell Line, STC-1
Implication of Transient Receptor Potential Vanilloid Type 1 in 14,15-Epoxyeicosatrienoic Acid-induced Angiogenesis
AssayWise