Calbryte™ 630 AM

Calbryte™ 630 ha sido desarrollado para mejorar la carga de células x-Rhod-1 y la respuesta de calcio mientras mantiene la longitud de onda espectral de x-Rhod-1, haciéndolo compatible con el juego de filtros Texas Red®.

Descripción

La medición del calcio es fundamental para numerosas investigaciones biológicas. Las sondas fluorescentes que muestran respuestas espectrales al unirse al calcio han permitido a los cientificos investigar los cambios en las concentraciones de calcio libre intracelular mediante microscopía de fluorescencia, citometría de flujo, espectroscopía de fluorescencia y lectores de microplacas de fluorescencia. x-Rhod-1 se usa comúnmente como un indicador de calcio fluorescente rojo. Sin embargo, x-Rhod-1 es solo moderadamente fluorescente en células vivas tras la hidrólisis de esterasa y tiene respuestas de calcio celular muy pequeñas.

Calbryte™ 630 ha sido desarrollado para mejorar la carga de células x-Rhod-1 y la respuesta de calcio mientras mantiene la longitud de onda espectral de x-Rhod-1, haciéndolo compatible con el juego de filtros Texas Red®. En células CHO y HEK, Cal-630™ AM tiene una respuesta de calcio celular que es mucho más sensible que x-Rhod-1. Los espectros de Calbryte™ 630 están bien separados de los de FITC, Alexa Fluor® 488 y GFP, lo que la convierte en una sonda de calcio ideal para multiplexar ensayos intracelulares con líneas celulares GFP o anticuerpos marcados con FITC/Alexa Fluor® 488. Calbryte™ 630 es una nueva generación de indicadores fluorescentes rojos para la medición del calcio intracelular. Su relación señal/fondo muy mejorada y sus propiedades de retención intracelular hacen de Calbryte™ 630 AM el indicador fluorescente de color rojo intenso más sólido para evaluar los objetivos de GPCR y los canales de calcio, así como para detectar sus agonistas y antagonistas en células vivas.

Al igual que otras cargas de células de colorante AM, el éster Calbryte™ 630 AM no es fluorescente y una vez que ingresa a la célula, es hidrolizado por la esterasa intracelular y se activa. El indicador activado es una molécula polar que ya no es capaz de difundirse libremente a través de la membrana celular, esencialmente atrapada dentro de las células.

CatalogoProductoPresentación
AAT-20720Calbryte™ 630 AM2 x 50 ug
AAT-20721Calbryte™ 630 AM10 x 50 ug
AAT-20722Calbryte™ 630 AM1 mg

Importante: Solo para uso en investigación (RUO). Almacenamiento: Congelar a  (< -15 °C), Minimizar la exposición a la luz.

Plataforma

Lector de Microplacas de Flourescencia

Excitación600 nm
Emisión640 nm
Corte630 nm
Placa RecomendadaParedes negras / fondo claro
Especificaciones InstrumentoModo de lectura inferior / Manejo de líquidos programable

Citómetro de flujo

Laser de Excitación640 nm
Filtro de Emisión660/20 nm
Especificaciones instrumentoCanal APC

Microscopio de Flourescencia

ExcitaciónTexas Red
EmisiónTexas Red
Placa recomendadaParedes negras / fondo claro

Espectro

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Propiedades espectrales

Excitación (nm)607
Emisión (nm)624
PREPARACION DE SOLUCIONES DE STOCK

A menos que se indique lo contrario, todas las soluciones madre no utilizadas deben dividirse en alícuotas de un solo uso y almacenarse a -20 °C después de la preparación. Evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación.

Solución madre Calbryte™ 630 AM
Prepare una solución madre de 2 a 5 mM de Calbryte™ 630 AM en DMSO anhidro.


PREPARACION DE SOLUCIONES DE TRABAJO

Solución de trabajo Calbryte™ 630 AM
El día del experimento, disuelva Calbryte™ 630 AM en DMSO o descongele una alícuota de la solución madre indicadora a temperatura ambiente. Prepare una solución de trabajo de tinte de 2 a 20 µM en un buffer de su elección (p. ej., Hanks y Hepes) con Pluronic® F-127 al 0,04 %. Para la mayoría de las líneas celulares, se recomienda Calbryte™ 630 AM a una concentración final de 4 a 5 μM. La concentración exacta de indicadores necesarios para la carga de células debe determinarse empíricamente.


Nota: El detergente no iónico Pluronic® F-127 a veces se usa para aumentar la solubilidad acuosa de Calbryte™ 630 AM. Se puede comprar una variedad de soluciones Pluronic® F-127 de AAT Bioquest. Reprentante CIDSA Mexico.
Nota: Si sus células contienen transportadores de aniones orgánicos, se puede agregar probenecid (1-2 mM) a la solución de trabajo del colorante (la concentración final en el pocillo será de 0,5-1 mM) para reducir la fuga de los indicadores desesterificados. Se puede comprar una variedad de productos de probenecid ReadiUse™, que incluyen sal de sodio soluble en agua y solución estabilizada, en AAT Bioquest. Reprentante CIDSA Mexico.

Calculadora

Preparación de la solución de stock común
Volumen de DMSO necesario para reconstituir la masa específica de Calbryte™ 630 AM a la concentración dada. Tenga en cuenta que el volumen es solo para preparar la solución madre. Consulte el protocolo experimental de muestra para conocer los buffers experimentales/fisiológicos apropiados.

0.1 mg0.5 mg1 mg5 mg10 mg
1 mM80.982 µL404.911 µL809.822 µL4.049 mL8.098 mL
5 mM16.196 µL80.982 µL161.964 µL809.822 µL1.62 mL
10 mM8.098 µL40.491 µL80.982 µL404.911 µL809.822 µL

Imagenes

Fig. 1

Figura 1. La gráfica ilustra la relación señal-ruido (SNR) x 100 %. La respuesta a la dosis de ATP se midió en células CHO-K1 con Calbryte™ 630 AM. Se sembraron células CHO-K1 durante la noche a 50.000 células/100 µl/pocillo en una placa costar de 96 pocillos de pared negra/fondo transparente. Se añadieron 100 µl de 10 µg/ml de Calbryte™ 630 AM en tampón HH con probenecid y se incubaron durante 60 min a 37 °C. A continuación, la solución de carga de tinte se eliminó y se reemplazó con 200 µl de tampón HH/pocillo. FlexStation 3 añadió ATP (50 µl/pocillo) para alcanzar las concentraciones finales indicadas.

Fig. 2

Figura 2. La liberación de calcio intracelular inducida por ATP se midió con Calbryte™ 630 AM. Las células se incubaron con colorante Calbryte™ 630 AM durante 30 min a 37 °C antes de añadir ATP 10 µM a las células. Se adquirió la línea de base y el resto de las células se analizaron después de la adición de ATP. La respuesta se midió a lo largo del tiempo. El análisis se realizó en el canal APC del citómetro de flujo NovoCyte™ 3000.

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Bibliografía

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Referencias

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