El metabolismo celular se caracteriza como la suma de cambios que tienen lugar dentro de la célula, a través de los cuales se utilizan energía y componentes para diversos procesos bioquímicos. La respiración celular, una función del metabolismo celular, descompone los azúcares y otros monosacáridos y aprovecha químicamente el ATP producido para crear energía.
Principalmente, la respiración celular implica tres pasos; la glucólisis, el ciclo del ácido cítrico y la fosforilación oxidativa. Estos procesos juntos forman varios componentes básicos que se utilizan en la creación de muchas moléculas esenciales, incluidas proteínas, lípidos, ácidos nucleicos y carbohidratos. La eliminación de desechos es una función esencial del metabolismo celular que permite la excreción funcional de componentes potencialmente tóxicos, incluidos compuestos nitrogenados, fosfatos y sulfatos.
Métodos y Análisis
Una de las técnicas más comunes para detectar y evaluar la actividad del metabolismo celular es a través de ensayos colorimétricos o fluorométricos. Estos ensayos se dirigen a analitos específicos conocidos por vías asociadas; por ejemplo, se puede elegir la detección de glucosa, hexoquinasa, piruvato, piruvato quinasa, lactato y glucógeno al identificar la ruta de la glucólisis. En el metabolismo de los ácidos grasos, los triglicéridos, los ácidos grasos libres y el pirofosfato pueden ser el objetivo. Además, la urea, el glutamato o la L-arginina pueden elegirse cuando se observa el metabolismo de la urea, y ATP, NAD, NADH, NADP o NADPH (o una combinación de los mismos) pueden ser el objetivo de la actividad metabólica general. Estos ensayos están disponibles comercialmente como kits y, aunque las especificaciones técnicas de cada uno difieren ligeramente, muchos pasos de cada proceso son similares.
Tabla 1. Ensayos bioquímicos para medir la actividad, formación o agotamiento de ATPE.Ensayo Ex/Abs (nm) Em (nm) Cutoff (nm)¹ Tipo Microplaca Presentación Cat No. Cell Meter™ Live Cell ATP Assay Kit - - - Pared negra/fondo claro 100 pruebas 23015 PhosphoWorks™ Colorimetric ATP Assay Kit 570 - - Fondo Claro 100 pruebas 21617 PhosphoWorks™ Fluorimetric ATP Assay Kit 540 590 570 Negra 100 pruebas 21620 PhosphoWorks™ Luminometric ATP Assay Kit *Maximized Luminescence* - - - Blanca 1 placa 21610 PhosphoWorks™ Luminometric ATP Assay Kit *Maximized Luminescence* - - - Blanca 10 placas 21621
| Ensayo | Ex/Abs (nm) | Em (nm) | Cutoff (nm)¹ | Tipo Microplaca | Presentación | Cat No. |
| Cell Meter™ Live Cell ATP Assay Kit | - | - | - | Pared negra/fondo claro | 100 pruebas | 23015 |
| PhosphoWorks™ Colorimetric ATP Assay Kit | 570 | - | - | Fondo Claro | 100 pruebas | 21617 |
| PhosphoWorks™ Fluorimetric ATP Assay Kit | 540 | 590 | 570 | Negra | 100 pruebas | 21620 |
| PhosphoWorks™ Luminometric ATP Assay Kit *Maximized Luminescence* | - | - | - | Blanca | 1 placa | 21610 |
| PhosphoWorks™ Luminometric ATP Assay Kit *Maximized Luminescence* | - | - | - | Blanca | 10 placas | 21621 |
Tabla 2. Comparación de Ensayos NAD/NADH & NADP/NADPH
En primer lugar, se deben preparar las muestras y se pueden utilizar varias células, tejidos u otros fluidos biológicos como material de partida. Los procesos son específicos para la muestra y el ensayo, aunque si las muestras contienen enzimas que pueden interferir con el análisis, es fundamental un paso de desproteinización. A continuación, si es necesario, se debe preparar una curva estándar y las muestras se pueden cargar en pozos con reactivos asociados. Después de un paso de incubación, protegidas de la luz, las muestras se pueden leer en un lector de microplacas adecuado a una longitud de onda descrita en el protocolo del kit.
Una vez que se han recopilado los datos, se deben promediar las lecturas duplicadas o triplicadas de cada estándar o muestra. Para corregir la absorbancia de cada pozo, el valor cero y el control de fondo deben restarse de cada lectura de densidad óptica (DO). Luego, estos valores se pueden trazar como una función de la concentración final y, normalmente, se utiliza un software de lectura de placas compatible para ayudar a interpretar y graficar los datos. Por lo general, los analitos se seleccionan por su concentración o actividad que ayuda a definir el alcance de los procesos metabólicos dentro de la célula. Las ecuaciones para medir ambos se enumeran a continuación.
| Medición de la concentración de sustrato | Medición de la actividad del sustrato |
| (x÷v) × D | (X÷(ΔT × V)) × D |
X = X = Cantidad de analito en la muestra encontrada a partir de la curva estándar(nmol)
V = V = Volumen de muestra agregado en pozos(μL)
D = Factor de dilución usado
ΔT = Tiempo de reacción entre dos puntos de tiempo. (T2 - T1)
ΔY = Actividad del sustrato en la muestra de prueba desde dos puntos de tiempo (Y2 - Y1)
Los kits para detectar y analizar analitos a través de luminiscencia siguen procesos muy similares a los ensayos colorimétricos y fluorométricos, aunque estos involucran bioluminiscencia química. El analito primero es digerido por su enzima asociada para liberar NADH, que la proluciferina absorbe fácilmente para formar luciferina. La luciferina reacciona con el ATP y su enzima oxidativa asociada, la luciferasa, que produce luminiscencia medida en unidades relativas de luz (RLU). Los protocolos también pueden incluir la construcción de una curva estándar para ayudar en el análisis, y los datos pueden evaluarse observando RLU a través de una serie de variables, incluida la concentración de sustrato, el tiempo en cultivo o comparando composiciones específicas de cada pocillo.
Herramientas
Esta calculadora en línea calcula la curva estándar de una serie de estándares de glucosa utilizando datos experimentales.
Haga clic en el botón de la derecha para ver nuestra herramienta Calculadora de curva estándar de glucosa.
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La metabolómica basada en resonancia magnética nuclear (RMN) también se puede utilizar para estudiar los extractos fisicoquímicos de muestras vivas. Hay muchas ventajas en el uso de RMN en solución acuosa, en comparación con las técnicas in vivo o ex vivo, ya que el número de metabolitos detectables y, por lo tanto, cuantificables, aumenta considerablemente. La mayor resolución espectral también mejora significativamente la distinción de las señales de metabolitos, a las que la metabolómica de RMN ofrece una mejor sensibilidad a partir de muestras concentradas.
En RMN también se puede utilizar una amplia variedad de muestras, incluyendo plasma, suero, saliva, etc., y estas deben ser desproteinizadas antes del análisis mediante precipitación o extracción para debilitar la intensidad de las resonancias de interferencia. Después de la derivatización y el tamponamiento, las muestras se someten a análisis para producir un perfil de RMN específico, constitutivo de muchos picos que representan varias moléculas dentro de la muestra. Para RMN, se pueden usar varios espectros de núcleos, incluidos 1H, 13C, 15N y 31P, y el perfil se puede interpretar mediante análisis estadístico multivariable con software de reconocimiento de patrones.
Los tipos comunes de análisis incluyen aquellos que cuantifican los componentes principales, asocian grupos jerárquicos, crean mínimos cuadrados parciales, función discriminante o incluso forman redes neuronales artificiales. En conjunto, este análisis ayuda a identificar y discriminar la función de los metabolitos en la muestra, donde las bases de datos se pueden usar de forma secundaria para validar la actividad de la ruta específica.
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Espectrometría de masas
Similar a la RMN, la espectrometría de masas (MS) distingue fácilmente las masas de los componentes moleculares, o más específicamente, las moléculas y fragmentos ionizados.
1. Las muestras se preparan en consecuencia y luego se someten a un paso de enfriamiento rápido para detener rápidamente cualquier actividad metabólica dentro de la célula. Si es necesario, las muestras deben someterse a un paso de purificación para separar la fase celular del medio extracelular.
2. La muestra se someterá a una fase de extracción que tiene como objetivo eliminar y disolver la mayor cantidad posible de metabolitos originales de la muestra. No existe una talla única para la extracción, ya que estos pasos pueden ser variables y deben determinarse empíricamente para cada combinación de muestra y reactivo.
3. Las muestras se concentran para eliminar parcialmente, si no totalmente, los solventes sobrantes.
Por lo general, las muestras se someterán a otra técnica para una mejor resolución antes del análisis de MS.
Cromatografía líquida (LC)
La cromatografía líquida (LC) se usa más comúnmente para separar metabolitos innecesarios según una columna y eluyente, aunque la cromatografía de gases (GC) también se puede usar para separar metabolitos volátiles y no volátiles.
Electroforesis capilar
Alternativamente, las técnicas de electroforesis capilar (CE) se pueden usar para separar metabolitos polares si solo se prefiere un pequeño volumen de muestra de prueba. Luego, las muestras se someterán a un análisis de MS que identifica específicamente los metabolitos utilizando su masa molecular y patrón de fragmentación. Los datos serán representativos de un gráfico de picos que grafica la relación masa:carga de los iones frente a su abundancia relativa en la muestra.
Metodologías: Comparación y Contrastes
Los métodos colorimétricos, fluorométricos y luminiscentes son cuantitativos, están disponibles comercialmente en muchas formas de kits, son de bajo costo y ofrecen tiempos experimentales rápidos. Se debe tener cuidado en la construcción de la curva estándar, ya que es contra lo que se hace referencia a los datos. En algunos casos, las muestras que producen señales mayores que el rango lineal del estándar más alto deben diluirse y volver a analizarse; por el contrario, lo contrario se aplica a las muestras que producen señales más bajas que el rango lineal del estándar más bajo.
Aunque las técnicas son similares, es importante tener en cuenta que la calorimetría requiere placas transparentes, la fluorometría requiere placas que tengan pocillos negros y fondos transparentes, mientras que los ensayos luminiscentes requieren placas blancas.
| Blanca | Negra | Negra, fondo claro | |
| Luminiscencia | xx | ||
| Fluorescencia | xx | x | |
| Absorbancia | xx | ||
| BRET | xx | ||
| FRET | xx | x | |
| AlphaScreen® | xx | ||
| Fluorescence Polarization (FP) | xx | ||
| HTRF® | xx | x |
Criterios de selección de métodos
Puede ser necesaria la solución de problemas, aunque los métodos se usan tanto que las técnicas útiles están comúnmente disponibles con muchos protocolos de kits. Aunque se puede usar un solo método de análisis estadístico, es normal usar varios juntos para proporcionar una explicación más completa de la concentración y actividad del metabolito para la muestra. La capacidad y el personal del laboratorio deben decidir en última instancia cuál es la mejor técnica (o técnicas) para evaluar la actividad del metabolismo celular.
• La RMN no es destructiva, no invasiva, altamente reproducible y puede proporcionar datos en tiempo real. La RMN no es solo cuantitativa, sino también cualitativa. Sin embargo, la RMN no es adecuada para distinguir metabolitos que no son solubles en agua (lípidos), ya que las imágenes producidas hacen que la identificación, cuantificación o clasificación de estos sea casi imposible. Las muestras con alto contenido de proteínas también pueden oscurecer las imágenes de moléculas más pequeñas en la muestra, razón por la cual a menudo es necesario un paso de desproteinización.
• MS ofrece una mayor sensibilidad, capacidades de alto rendimiento y menos costo que la RMN, aunque los pasos involucrados, a saber, la extracción y la concentración, a menudo requieren mucho tiempo. Otra consideración de esta técnica debe ser que, aunque necesaria, inherentemente, la extracción siempre causará la pérdida de la muestra.
• Para usar GC-MS, las muestras deben ser volátiles para separarlas en la columna, lo que no ocurre con muchos metabolizados naturales. Por lo tanto, se requiere un paso de derivatización. Es importante tener en cuenta que GC-MS tampoco es adecuado para analizar compuestos termolábiles. Técnicamente, CE-MS es más rápido y potencialmente más simple que GC-MS; sin embargo, estos métodos requieren una interfaz y una tecnología específicas, por lo que no se usan tan ampliamente.
• LC-MS suele ser el método de elección, ya que puede proporcionar información sobre muchos analitos químicamente diversos y termolábiles que pueden ser difíciles de separar con otros métodos.
Información
Tabla 3. Productos para Metabolismo Celular Cat# Descripción Presentación 40007 Amplite® Choline Quantitation Kit 200 Pruebas 10059 Amplite® Colorimetric Ammonia Quantitation Kit *Blue Color* 200 Pruebas 13830 Amplite® Colorimetric Beta-Hydroxybutyrate (Ketone Body) Assay Kit 200 Pruebas 5522 Amplite® Colorimetric Biotin Quantitation Kit 200 Pruebas 13811 Amplite® Colorimetric D-Lactate Assay Kit 200 Pruebas 13815 Amplite® Colorimetric L-Lactate Assay Kit 200 Pruebas 13840 Amplite® Colorimetric Oxaloacetate Assay Kit *Red Color* 200 Pruebas 13821 Amplite® Colorimetric Pyruvate Assay Kit 200 Pruebas 10058 Amplite® Colorimetric Urea Quantitation Kit *Blue Color* 200 Pruebas 13842 Amplite® Colorimetric Xanthine Assay Kit 200 Pruebas 40001 Amplite® Ethanol Quantitation Kit 200 Pruebas 11403 Amplite® Fluorimetric Acetylcholine Assay Kit *Red Fluorescence* 200 Pruebas 13835 Amplite® Fluorimetric Ascorbic Acid Assay Kit 200 Pruebas 13831 Amplite® Fluorimetric Beta-Hydroxybutyrate (Ketone Body) Assay Kit 200 Pruebas 13810 Amplite® Fluorimetric D-Lactate Assay Kit 200 Pruebas 13814 Amplite® Fluorimetric L-Lactate Assay Kit 200 Pruebas 13841 Amplite® Fluorimetric Oxaloacetate Assay Kit *Red Fluorescence* 200 Pruebas 13820 Amplite® Fluorimetric Pyruvate Assay Kit 200 Pruebas 13843 Amplite® Fluorimetric Xanthine Assay Kit 200 Pruebas 5521 ReadiLink™ Protein Biotinylation Kit *Powered by ReadiView™ Biotin Visionization Technology* 1 kit
Tabla 3. Productos para Metabolismo Celular Cat# Descripción Presentación 40007 Amplite® Choline Quantitation Kit 200 Pruebas 10059 Amplite® Colorimetric Ammonia Quantitation Kit *Blue Color* 200 Pruebas 13830 Amplite® Colorimetric Beta-Hydroxybutyrate (Ketone Body) Assay Kit 200 Pruebas 5522 Amplite® Colorimetric Biotin Quantitation Kit 200 Pruebas 13811 Amplite® Colorimetric D-Lactate Assay Kit 200 Pruebas 13815 Amplite® Colorimetric L-Lactate Assay Kit 200 Pruebas 13840 Amplite® Colorimetric Oxaloacetate Assay Kit *Red Color* 200 Pruebas 13821 Amplite® Colorimetric Pyruvate Assay Kit 200 Pruebas 10058 Amplite® Colorimetric Urea Quantitation Kit *Blue Color* 200 Pruebas 13842 Amplite® Colorimetric Xanthine Assay Kit 200 Pruebas 40001 Amplite® Ethanol Quantitation Kit 200 Pruebas 11403 Amplite® Fluorimetric Acetylcholine Assay Kit *Red Fluorescence* 200 Pruebas 13835 Amplite® Fluorimetric Ascorbic Acid Assay Kit 200 Pruebas 13831 Amplite® Fluorimetric Beta-Hydroxybutyrate (Ketone Body) Assay Kit 200 Pruebas 13810 Amplite® Fluorimetric D-Lactate Assay Kit 200 Pruebas 13814 Amplite® Fluorimetric L-Lactate Assay Kit 200 Pruebas 13841 Amplite® Fluorimetric Oxaloacetate Assay Kit *Red Fluorescence* 200 Pruebas 13820 Amplite® Fluorimetric Pyruvate Assay Kit 200 Pruebas 13843 Amplite® Fluorimetric Xanthine Assay Kit 200 Pruebas 5521 ReadiLink™ Protein Biotinylation Kit *Powered by ReadiView™ Biotin Visionization Technology* 1 kit
| Cat# | Descripción | Presentación |
| 40007 | Amplite® Choline Quantitation Kit | 200 Pruebas |
| 10059 | Amplite® Colorimetric Ammonia Quantitation Kit *Blue Color* | 200 Pruebas |
| 13830 | Amplite® Colorimetric Beta-Hydroxybutyrate (Ketone Body) Assay Kit | 200 Pruebas |
| 5522 | Amplite® Colorimetric Biotin Quantitation Kit | 200 Pruebas |
| 13811 | Amplite® Colorimetric D-Lactate Assay Kit | 200 Pruebas |
| 13815 | Amplite® Colorimetric L-Lactate Assay Kit | 200 Pruebas |
| 13840 | Amplite® Colorimetric Oxaloacetate Assay Kit *Red Color* | 200 Pruebas |
| 13821 | Amplite® Colorimetric Pyruvate Assay Kit | 200 Pruebas |
| 10058 | Amplite® Colorimetric Urea Quantitation Kit *Blue Color* | 200 Pruebas |
| 13842 | Amplite® Colorimetric Xanthine Assay Kit | 200 Pruebas |
| 40001 | Amplite® Ethanol Quantitation Kit | 200 Pruebas |
| 11403 | Amplite® Fluorimetric Acetylcholine Assay Kit *Red Fluorescence* | 200 Pruebas |
| 13835 | Amplite® Fluorimetric Ascorbic Acid Assay Kit | 200 Pruebas |
| 13831 | Amplite® Fluorimetric Beta-Hydroxybutyrate (Ketone Body) Assay Kit | 200 Pruebas |
| 13810 | Amplite® Fluorimetric D-Lactate Assay Kit | 200 Pruebas |
| 13814 | Amplite® Fluorimetric L-Lactate Assay Kit | 200 Pruebas |
| 13841 | Amplite® Fluorimetric Oxaloacetate Assay Kit *Red Fluorescence* | 200 Pruebas |
| 13820 | Amplite® Fluorimetric Pyruvate Assay Kit | 200 Pruebas |
| 13843 | Amplite® Fluorimetric Xanthine Assay Kit | 200 Pruebas |
| 5521 | ReadiLink™ Protein Biotinylation Kit *Powered by ReadiView™ Biotin Visionization Technology* | 1 kit |