Los ensayos de proliferación celular son herramientas valiosas con una amplia gama de aplicaciones en biología celular y investigación de descubrimiento de fármacos. Se utilizan comúnmente para evaluar la salud celular normal y son esenciales para evaluar la potencia antiproliferativa y la toxicidad compuesta de nuevos agentes quimioterapéuticos. AAT Bioquest ofrece varias estrategias para evaluar la proliferación celular basadas en el seguimiento de generaciones de división celular o el seguimiento de parámetros críticos de la salud celular, incluida la actividad metabólica, la síntesis de ADN o la concentración de ATP. Seleccione entre una amplia gama de reactivos colorimétricos tradicionales para determinar la proliferación celular, en particular sales de tetrazolio, y varios ensayos basados en fluorescencia altamente sensibles para aplicaciones de citometría de flujo, imágenes y microplacas.
El método más preciso para analizar la proliferación celular es medir el ADN recién sintetizado mediante la incorporación de BrdU (5-bromo-2′-desoxiuridina) durante la replicación del ADN. Aunque es muy preciso y reproducible, este método puede resultar bastante tedioso ya que es necesaria la detección posterior con anticuerpos anti-BrdU fluorescentes para medir la proliferación. Alternativamente, la proliferación celular se puede evaluar más rápidamente midiendo la tasa de actividad metabólica con tintes escindidos WST, resazurina o esterasa celular o rastreando generaciones de división celular con tintes CytoTell™ o CFSE. En última instancia, seleccionar el ensayo de proliferación celular más adecuado para su propósito depende principalmente del tipo de célula, el protocolo de investigación y el mecanismo de acción que desea estudiar. La siguiente tabla proporciona una descripción general de los tipos de ensayos de proliferación celular disponibles.
| Mecanismo de acción | Reactivos y ensayos a usar | Platforma | Principio |
| ADN recién sintetizado |
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| Durante la fase S, los análogos de timidina se incorporan al ADN recién sintetizado y luego se detectan mediante sondas de anticuerpos fluorescentes. |
| Indicadores Metabolicos |
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| Detecta indirectamente la proliferación mediante el seguimiento de la actividad metabólica. Las células sanas reducen los sustratos que pueden leerse mediante absorbancia o fluorescencia. |
| Seguimiento de generaciones de división celular |
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| Etiqueta células vivas con tintes de seguimiento fluorescentes. A medida que las células se dividen, el tinte fluorescente se distribuye uniformemente entre las células hijas, lo que da como resultado una reducción progresiva a la mitad de la intensidad de la fluorescencia con cada generación sucesiva. |
| Concentraciones ATP |
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| Las células muertas o moribundas contienen poco o nada de ATP, lo que crea una estrecha relación lineal entre la concentración de ATP medida en un lisado celular y el número de células. Por lo tanto, se pueden utilizar ensayos de determinación de ATP para evaluar la proliferación. |
La medición in situ del ADN recién sintetizado es el método más fiable y preciso para identificar células en proliferación. Una forma de lograr esto implica incorporar el análogo de timidina, BrdU (17030), en el ADN recién replicado durante la fase S del ciclo celular. Luego, las células marcadas con BrdU en proliferación se pueden medir utilizando anticuerpos anti-BrdU marcados con fluorescencia. La tinción con BrdU es adecuada para diversas aplicaciones, incluidas IHC, ICC y ELISA, y se puede teñir con otros biomarcadores de interés en citometría de flujo. Ofrecemos conjugados fluorescentes del clon de anticuerpo monoclonal de ratón anti-BrdU Bu20a marcado con PE (V103305) y del clon de anticuerpo monoclonal de ratón anti-BrdU Bu20a (V103300) y el clon MoBu-1 (V103295) sin marcar que se pueden etiquetar con nuestra tecnología más brillante y Tintes fotoestables iFluor™.
A diferencia de los ensayos BrdU, los ensayos de proliferación celular Bucculite™ XdU no dependen de anticuerpos para cuantificar el ADN naciente, ni requieren la desnaturalización del ADN necesaria para facilitar la detección de anticuerpos de los nucleósidos marcados con BrdU. Más bien, los ensayos de proliferación celular Bucculite™ XdU utilizan una mezcla patentada de análogos de timidina que contienen alquinos, XdU, que se incorpora al ADN recién sintetizado y posteriormente se detecta mediante una cicloadición de azida-alquino catalizada por cobre (es decir, reacción de clic, Figura 1).
Principio del ensayo de proliferación celular Bucculite™ XdU. Las células que proliferan en presencia de XdU incorporan el compuesto en bases de timidina durante la fase S. La azida marcada con fluoróforo reacciona con el XdU incorporado para permitir la detección mediante imágenes o citometría de flujo (figura realizada en BioRender).
Dado que la reacción de clic utiliza restos biortogonales para detectar células en proliferación, la interferencia de fondo es mínima. Más importante aún, debido a las suaves condiciones de reacción, los ensayos de proliferación celular Bucculite™ XdU preservan la morfología celular, los sitios de unión al antígeno y la integridad de la muestra, brindando al usuario la oportunidad de realizar análisis multiplexados con colorantes del ciclo celular, anticuerpos contra marcadores de la superficie celular y fluorescentes. proteínas. Después de la incorporación de XdU, la reacción de clic y los pasos de lavado posteriores se pueden completar en menos de 60 minutos, y el ADN naciente se puede cuantificar utilizando sistemas de imágenes estándar o un citómetro de flujo. También están disponibles ensayos de proliferación celular Bucculite™ FdU sin cobre, seguros para el medio ambiente, en fluorescencia verde, roja y rojo intenso. Estos kits utilizan nuestra química de etiquetado patentada Buccutite™ para facilitar la detección de ADN recién sintetizado en células en proliferación activa.
La proliferación celular se detectó mediante el ensayo de proliferación celular Bucculite™ XdU. Las células HeLa se procesaron utilizando los reactivos y el protocolo de fijación/detección proporcionados en el kit de imágenes Bucculite™ XdU Cell Proliferation iFluor™ 488 (22326) y el kit de imágenes Bucculite™ XdU Cell Proliferation iFluor™ 647 (22328). Ambas muestras se tiñeron con tinción de ácido nucleico Hoechst® 33342 (17530) y se tomaron imágenes con un microscopio de fluorescencia.
| Producto | Medida | Cat No. |
| Bucculite™ Flow Cytometric XdU Cell Proliferation Assay Kit *Blue Laser-Compatible* | 100 Tests | 22323 |
| Bucculite™ Flow Cytometric XdU Cell Proliferation Assay Kit *Red Laser-Compatible* | 100 Tests | 22325 |
| Bucculite™ XdU Cell Proliferation Fluorescence Imaging Kit *Green Fluorescence* | 200 Tests | 22326 |
| Bucculite™ XdU Cell Proliferation Fluorescence Imaging Kit *Red Fluorescence* | 200 Tests | 22327 |
| Bucculite™ XdU Cell Proliferation Fluorescence Imaging Kit *Deep Red Fluorescence* | 200 Tests | 22328 |
| Bucculite™ FdU Cu-Free Cell Proliferation Fluorescence Imaging Kit *Green Fluorescence* | 200 Tests | 22305 |
| Bucculite™ FdU Cu-Free Cell Proliferation Fluorescence Imaging Kit *Red Fluorescence* | 200 Tests | 22315 |
| Bucculite™ FdU Cu-Free Cell Proliferation Fluorescence Imaging Kit *Deep Red Fluorescence* | 200 Tests | 22320 |
| BrdU [5-Bromo-2'-deoxyuridine] *CAS 59-14-3* | 25 mg | 17030 |
| BrdUTP [5-Bromo-2'-deoxyuridine 5'-triphosphate] *10 mM in TE Buffer* *CAS 102212-99-7* | 100 ul | 17031 |
| BrUTP [5-Bromouridine 5'-triphosphate] *10 mM in TE buffer* *CAS 161848-60-8* | 100 ul | 17032 |
Los indicadores CFSE y CytoTell™ son colorantes de seguimiento fluorescentes útiles para monitorear la proliferación celular en células vivas mediante citometría de flujo. A medida que las células se dividen, el tinte fluorescente se distribuye uniformemente entre las células hijas, lo que da como resultado una reducción progresiva a la mitad de la intensidad de la fluorescencia con cada generación sucesiva. Estos colorantes de proliferación se pueden utilizar para rastrear la proliferación celular a largo plazo tanto in vitro como in vivo durante varias generaciones.
CFSE (diacetato de carboxifluoresceína, éster succinimidílico, 22022) y ReadiUse™ CFSE (22028) son indicadores de proliferación fluorescentes verdes permeables a las células que emiten una señal de fluorescencia a 517 nm cuando se excitan con el láser de iones de argón de 488 nm. Ambos colorantes se difunden pasivamente a través de las membranas celulares no comprometidas, mediante las cuales las reacciones enzimáticas con esterasas intracelulares escinden los grupos acetato de la CFSE para producir una carboxifluoresceína reactiva con aminas, SE que se une covalentemente a las proteínas dentro de la célula. Si bien el CFSE sigue siendo ampliamente utilizado como indicador de proliferación fluorescente verde excitado a 498 nm, no está exento de advertencias. CFSE es altamente tóxico para las células, susceptible a la fuga de tinte y se sabe que se derrama en los canales PE y PE-Texas Red.
Los tintes CytoTell™ son una serie de trazadores fluorescentes permeables a las células diseñados para monitorear la proliferación celular en células vivas sin ninguno de los inconvenientes del CFSE. Tras la difusión pasiva a través de las membranas celulares, los colorantes CytoTell™ son hidrolizados por esterasas intracelulares para producir colorantes reactivos con aminas o tiol altamente fluorescentes que se unen irreversiblemente a grupos amina o tiol en proteínas intracelulares. La citotoxicidad es mínima y los tintes se conservan bien dentro de las células durante varias generaciones de división. Visualice hasta 9 generaciones usando CytoTell™ UltraGreen (22240). Los tintes CytoTell™ están disponibles en 7 colores diferentes de emisión de fluorescencia que ofrecen una mayor flexibilidad en el análisis multicolor. Se pueden fijar y permeabilizar para analizar objetivos intracelulares utilizando fijadores estándar que contienen formaldehído y tampones de permeabilización a base de saponina.
Ensayo de proliferación celular utilizando CytoTell™ Green y CFSE. Se tiñeron células Jurkat (~2x106 células/ml) con CytoTell™ Green o CFSE el día 0. Luego, las células se pasaron en serie en una proporción de 1:1 el día especificado. La intensidad de la fluorescencia se midió con un citómetro de flujo ACEA NovoCyte 3000 en el canal FITC el día del paso. Los picos de diferentes colores representan generaciones sucesivas.
| Producto | Fuente Excitación (nm) | Ex (nm) | Em (nm) | Medida | Cat No. |
| CytoTell™ Blue | Violet Laser (405 nm) | 410 | 445 | 500 Tests | 22251 |
| CytoTell™ Violet 500 | Violet Laser (405 nm) | 415 | 499 | 500 Tests | 22248 |
| CFSE [5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester] | Blue Laser (488 nm) | 498 | 517 | 25 mg | 22022 |
| ReadiUse™ CFSE [5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester] | Blue Laser (488 nm) | 498 | 517 | 5 x 500 µg | 22028 |
| CytoTell™ Green | Blue Laser (488 nm) | 510 | 525 | 500 Tests | 22253 |
| CytoTell™ UltraGreen | Blue Laser (488 nm) | 492 | 519 | 500 Tests | 22240 |
| CytoTell™ Orange | Green Laser (531 nm) | 541 | 560 | 500 Tests | 22257 |
| CytoTell™ Red 590 | Green Laser (531 nm) | 560 | 574 | 500 Tests | 22261 |
| CytoTell™ Red 650 | Red Laser (633/647 nm) | 626 | 643 | 500 Tests | 22255 |
| CytoTell™ Blue | Violet Laser (405 nm) | 410 | 445 | 2 x 500 Tests | 22252 |
Los indicadores metabólicos, como las sales de tetrazolio y la resazurina, miden el potencial de reducción celular en células metabólicamente activas para evaluar la proliferación. Después de la reducción, estos sustratos producen productos colorimétricos brillantes que se pueden medir utilizando un espectrofotómetro o un lector de microplacas en configuraciones de alto o bajo rendimiento. La resazurina reducida también se puede medir utilizando un lector de microplacas de fluorescencia.
Los cuatro tipos de sales de tetrazolio utilizados para medir la proliferación son MTT, MTS, XTT y WST-8. La reducción de MTT es la más común; sin embargo, para la mayoría de los ensayos de MTT comerciales, se requiere la solubilización del producto de formazán púrpura en DMSO o isopropanol antes de la cuantificación. El práctico kit colorimétrico de proliferación celular MTT Cell Meter™ (22768) simplifica la tarea de contar células en un formato fácil de mezclar y leer sin necesidad de solubilización. La concentración de formazán determinada por la densidad óptica a 560 nm es directamente proporcional al número de células vivas.
La proliferación celular se determinó utilizando el kit de proliferación celular colorimétrica MTT Cell Meter™. Se añadieron células HeLa de 0 a 40.000 células/pocillo/100 µl a una placa de 96 pocillos de fondo transparente durante la noche. La absorbancia se midió a 560 nm usando un lector SpectraMax (Molecular Devices). Se detectaron 500 células/pocillo en comparación con ~5000 células/pocillo con el kit de ensayo MTT de Sigma.
Entre las otras sales de tetrazolio, la WST-8 soluble en agua ofrece la mayor sensibilidad. La reducción de WST-8 mediante deshidrogenasas celulares produce cristales de formazán de color naranja solubles en agua que no requieren solubilización antes de la cuantificación. La concentración del producto de formazán se puede determinar midiendo la absorbancia a 460 nm y es proporcional al número de células vivas. El kit de cuantificación de células colorimétrica WST-8 Cell Meter™ proporciona un ensayo sensible con una linealidad excepcional de hasta ~106 células por pocillo. No se requiere premezcla de componentes, ya que el sustrato WST-8 se proporciona convenientemente en una solución que se puede agregar directamente a las células. Cada kit proporciona reactivos suficientes para ~1000 (22770) o ~5000 pruebas (22771) utilizando una microplaca estándar de 96 pocillos. WST-8 también está disponible como reactivo independiente en unidades de 25 mg (15705), 100 mg (15706) y 1 g (15707) suministradas como soluciones acuosas de 50 mM.
La proliferación celular se determinó utilizando el kit de cuantificación de células colorimétrica WST-8 Cell Meter™. Se añadieron células HeLa de 0 a 10.000 células/pocillo/100 µl en una placa de 96 pocillos de fondo transparente. La absorbancia se midió a 460 nm usando un lector SpectraMax (Molecular Devices).
| Producto | Medida | Cat No. |
| Cell Meter™ Colorimetric MTT Cell Proliferation Kit | 1000 Tests | 22768 |
| Cell Meter™ Colorimetric MTT Cell Proliferation Kit | 5000 Tests | 22769 |
| Cell Meter™ Colorimetric WST-8 Cell Quantification Kit | 1000 Tests | 22770 |
| Cell Meter™ Colorimetric WST-8 Cell Quantification Kit | 5000 Tests | 22771 |
| ReadiUse™ WST-8 *50 mM aqueous solution* | 25 mg | 15705 |
| ReadiUse™ WST-8 *50 mM aqueous solution* | 100 mg | 15706 |
| ReadiUse™ WST-8 *50 mM aqueous solution* | 1 g | 15707 |
| ReadiUse™ MTS Reagent *50 mM aqueous solution* | 5 mL | 15710 |
Al igual que las sales de tetrazolio antes mencionadas, el indicador de oxidación-reducción resazurina (15700) puede resultar útil para cuantificar la proliferación celular. Después de la reducción, la resazurina azul no fluorescente produce un producto de resorufina altamente fluorescente y de color rosa que es compatible con lectores de microplacas de fluorescencia y absorbancia. La señal fluorescente o colorimétrica es proporcional al número de células vivas de la muestra. Se ha informado que la resazurina se utiliza con éxito en una amplia gama de tipos de células, incluidas bacterias, levaduras, hongos, protozoos y células cultivadas de mamíferos.
| Producto | Abs (nm) | Ex/Em (nm) | Medida | Cat No. |
| Resazurin, sodium salt *CAS 62758-13-8* | 605 | 571/584 | 100 mg | 15700 |
El ATP, que está presente en todas las células metabólicamente activas y prácticamente no existe en las células muertas, es un biomarcador adecuado para identificar células viables. Se han utilizado ensayos para cuantificar ATP para determinar la proliferación celular y la citotoxicidad en células bacterianas y de mamíferos y para detectar contaminación bacteriana de bajo nivel en muestras como agua, suelo y sangre. Si bien se pueden utilizar varios métodos de detección, los investigadores suelen elegir ensayos de ATP basados en bioluminiscencia de luciferina-luciferasa para medir la proliferación celular debido a su mayor sensibilidad. Los kits de ensayo luminométricos de ATP PhosphoWorks™ proporcionan un método simple y homogéneo para medir ATP utilizando luciferasa de luciérnaga y su sustrato luciferina. En presencia de Mg2+, la luciferasa de luciérnaga cataliza la reacción de luciferina, ATP y O2 para producir luz a ~560 nm que puede detectarse utilizando un luminómetro. La concentración de ATP presente es proporcional al número de células viables en la muestra. También está disponible un kit de ensayo colorimétrico de ATP PhosphoWorks™ (21617) y un kit de ensayo fluorimétrico de ATP PhosphoWorks™ (21620) que pueden detectar ~3 µM o ~0,4 µM de ATP en un volumen de reacción de 100 µL, respectivamente.
La proliferación celular se determinó utilizando el kit de proliferación celular colorimétrica MTT Cell Meter™. Se añadieron células HeLa de 0 a 40.000 células/pocillo/100 µl a una placa de 96 pocillos de fondo transparente durante la noche. La absorbancia se midió a 560 nm usando un lector SpectraMax (Molecular Devices). Se detectaron 500 células/pocillo en comparación con ~5000 células/pocillo con el kit de ensayo MTT de Sigma.
| Cat# | Producto | Medida |
| 21601 | Readiuse™ Rapid Luminometric ATP Assay Kit | 100 Tests |
| 21602 | Readiuse™ Rapid Luminometric ATP Assay Kit | 1000 Tests |
| 21603 | Readiuse™ Rapid Luminometric ATP Assay Kit | 10,000 Tests |
| 21608 | PhosphoWorks™ Luminometric ATP Assay Kit *Extended Luminescence* | 10 Plates |
| 21609 | PhosphoWorks™ Luminometric ATP Assay Kit *Extended Luminescence* | 1 Plate |
| 21610 | PhosphoWorks™ Luminometric ATP Assay Kit *Maximized Luminescence* | 1 Plate |
| 21612 | PhosphoWorks™ Luminometric ATP Assay Kit *DTT-Free* | 1 Plate |
| 21613 | PhosphoWorks™ Luminometric ATP Assay Kit *DTT-Free* | 10 Plates |
| 21617 | PhosphoWorks™ Colorimetric ATP Assay Kit | 100 Tests |
| 21620 | PhosphoWorks™ Fluorimetric ATP Assay Kit | 100 Tests |
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